SCHWINGUNGSSPEKTROSKOPIE – Fingerabdruck der Moleküle, Teil 2

Zur Schwingungsspektroskopie gehört wie die IR- auch die Raman-Spektroskopie. Das Projekt Berzelius bietet ein portables Hightech-Raman-Gerät an, das nicht viel grösser als ein Smartphone ist. Zur Funktionsweise: Ein Laser schiesst auf die Probe. Im Spektrum des an der Probe gestreuten Lichts werden neben der eingestrahlten Frequenz (Rayleigh-Streuung) noch weitere Frequenzen wie die Raman-Streuung beobachtet. Dazu mehr auf den folgenden Seiten. Die Frequenzunterschiede zum eingestrahlten Licht entsprechen den für das Material charakteristischen Energien von Rotationen und Schwingungen der Moleküle. Aus dem erhaltenen Spektrum lassen sich, ähnlich dem IR-Spektrum, Rückschlüsse auf die untersuchte Substanz ziehen. Die physikalischen Grundlagen und die Anregung der Probe sind jedoch unterschiedlich.

Der österreichische Physiker Adolf Gustav Stephan Smekal (1895–1959) sagte den Raman-Effekt bereits 1923 voraus. Es war aber der indische Physiker Chandrasekhara Venkata Raman (1888–1970), der ihn 1928 erstmals nachweisen konnte. Dafür erhielt er 1930 den Nobelpreis der Physik.  

Wie bei der IR- existieren auch bei der Raman-Spektroskopie charakteristische Bereiche. Die Fingerprint-Region (400–1800 cm ̄ ¹) dient dem Identifizieren von unbekannten oder Verifizieren von bekannten Substanzen. 
Die Schwingungen der funktionellen Gruppen weisen typische Raman-Verschiebungen bei Wellenzahlen oberhalb von 1500  cm ̄ ¹ auf. So zeigt die  C=O-Streckschwingung eine Bande zwischen 1700 und 1730 cm ̄ ¹. Dieser Bereich ist typisch für alle Moleküle mit einer Carbonylgruppe, wie z. B. Ketone und Aldehyde. Die Region unterhalb 400  cm ̄ ¹ ermöglicht die Analyse von Mineralien, Edelsteinen, Metallen und Halbleitern.

Neben den Schwingungen der funktionellen Gruppen erscheinen Gerüstschwingungen der C–C-Bindungen von cyclischen Kohlenstoffverbindungen (Ringen) im Raman-Spektrum wesentlich stärker als im IR-Spektrum. Diese Skelett-Schwingungen befinden sich meistens bei Raman-Verschiebungen unterhalb von 1500 cm ̄ ¹. Sie haben stoffspezifische Muster. Man nennt diese Region deshalb Fingerprint-Region. Sie ist von grosser Bedeutung bei der Identifikation von Stoffen. Mit geeigneten Algorithmen kann die Fingerprint-Region mit Spektren aus einer Datenbank abgeglichen und ein Stoff mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit identifiziert werden.

Quelle:  Basics of Raman spectroscopy (anton-paar.com)

Das Spektrum der unbekannten Spirituose im «Flachmann» wurde mit dem portablen Mira M-3 mittels Vorsatzlinse direkt durch die Glasflasche erstellt.

Das Ethanol aus alkoholischen Getränken wird im gesamten Verdauungstrakt aufgenommen. Dies beginnt in geringem Umfang bereits in der Mundschleimhaut. Etwa 20 % werden im Magen resorbiert, der Rest im Dünndarm. Der in Magen und Darm aufgenommene Alkohol gelangt zunächst mit dem Blut in die Leber, wo er teilweise abgebaut wird. Blut verteilt den Alkohol über den ganzen Körper bis ins Gehirn. Faktoren, welche die Durchblutung steigern, beispielsweise Wärme in Irish Coffee, Zucker in Likör oder Kohlendioxid in Sekt, beschleunigen die Aufnahme von Alkohol, während Fett sie verlangsamt.

Die Leber baut Alkohole nach der Resorption durch Enzyme ab. Im Falle des Trinkalkohols Ethanol entstehen durch Oxidation Acetaldehyd und im nächsten Schritt Essigsäure. Letztere wird dann im Citronensäurezyklus und der Atmungskette unter Energiegewinnung zu Kohlendioxid und Wasser abgebaut. Leider zeigt eine Vergiftung durch Methanol zunächst keine anderen Symptome als ein normaler Rausch durch Ethylalkohol: Müdigkeit, Kopfschmerzen und Übelkeit. Die Oxidation von Methanol führt aber zum giftigen Formaldehyd, das zur Ameisensäure oxidiert wird. Ameisensäure führt nach einer häufig symptomlosen Latenzzeit von 6 bis 30 Stunden nach Methanolaufnahme zur Ausbildung einer lebensbedrohenden metabolischen Acidose, da sie vom menschlichen Stoffwechsel nur sehr langsam abgebaut wird. Dosen von 0.1 g Methanol pro kg Körpergewicht sind bereits gefährlich, über 1 g pro kg Körpergewicht lebensbedrohlich. Die Vergiftungssymptome einer Methanolintoxikation verlaufen in drei Phasen.

• Direkt nach Aufnahme von Methanol zeigt sich wie beim Ethanol ein narkotisches Stadium, die berauschende Wirkung ist jedoch geringer. 
• Nach der häufig asymptomatischen Latenzphase treten Kopfschmerzen, Schwächegefühl, Übelkeit, Erbrechen, Schwindel, beschleunigte Atmung auf – die Folgen der sich ausbildenden metabolischen Acidose. Charakteristisch ist die Schädigung von Nerven, insbesondere am Auge. Netzhautödeme bedingen ein nur noch verschwommenes Sehen und können zur irreversiblen Erblindung führen. 
• Zuletzt kann dann noch eine tödliche Atemlähmung auftreten.    
  

Am 1. Oktober 2016 führte die Schweiz die beweissichere Kontrolle durch Messung des Atemalkoholgehalts ein. Seither ist bei polizeilichen Alkoholkontrollen im Strassenverkehr nur noch in Ausnahmefällen eine Blutprobe nötig. Gemessen wird nicht mehr der Blutalkoholgehalt, sondern die Menge Alkohol in der Atemluft. Die Geräte zeigen keine Promillewerte  (Gramm Alkohol pro Kilogramm Blut) mehr an, sondern Milligramm Alkohol pro Liter Atemluft. Damit ändern sich auch die Werte: Was bisher 0.50 Promille Blutalkohol waren, sind ab jetzt 0.25 Milligramm Alkohol pro Liter Atemluft; 0.8 Promille entsprechen 0.4 Milligramm pro Liter. Eine «Halbierung» der Grenzwerte, die aber faktisch der gleichen Menge an konsumierten Alkohol entspricht.

Zur Messung: Zwei unterschiedliche und unabhängige Sensoren bestimmen die Konzentration des Alkohols in einer Atemprobe. Ein Infrarotsensor misst die Absorption von Ethanol in der Atemluft – das ist eine physikalische Methode –, während ein elektrochemischer Sensor chemische Reaktionen verwendet. Die Werte der physikalisch und chemisch gemessenen  Atemalkoholkonzentrationen müssen in engen Grenzen übereinstimmen.

Schon geringe Mengen Alkohol führen zu einer enthemmenden Wirkung und zu einer Steigerung der Redseligkeit. Der Konsum von 0.7 bis 1 Liter Bier oder 0.5 Liter Wein führt zu einem Blutalkoholspiegel von 0.5 bis 1 ‰ und einem «Schwips» mit Enthemmung und Selbstüberschätzung.  Die  Reaktionsfähigkeit lässt stark nach. Nach dem Konsum von etwa 1.7 bis 3 Liter Bier oder 1 bis 1.5 Liter Wein ist eine deutliche Betrunkenheit sichtbar. Es beginnt eine Ataxie (Störung der Bewegungskoordination), verminderte Sehleistung, mit teilweise aggressivem Verhalten. Ein Alkoholpegel von 2 bis 3 ‰ führt zu Trunkenheit, Rausch, starker Ataxie (Schädigung von Nervenzellen), Denk- und Orientierungsstörungen sowie später teils zur Amnesie (Gedächtnisverlust). Noch höhere Konzentrationen führen zu schwerem Rausch, Benommenheit bis zur Bewusstlosigkeit, Aspiration (Eindringen von Erbrochenem in den Atemwege) und Unterkühlung. Bei Menschen, die nicht an regelmässig grössere Alkoholmengen gewöhnt sind, kann es zum Tod durch Atemlähmung kommen. Ein Blutalkoholspiegel von 6 bis 8 ‰ ist auch für schwere Alkoholiker meist tödlich. 
Alkoholmissbrauch schädigt diverse Organe. Bei Alkoholismus werden vor allem Leber (Leberverfettung und Leberzirrhose) und Gehirn (Absterben von Neuronen) geschädigt.

Glucose und Fructose sind Isomere*: Das heisst, sie haben die gleiche Summenformel – C₆H₁₂O₆ –, aber eine unterschiedliche Strukturformel. Glucose enthält eine Aldehyd-, Fructose eine Keto-Gruppe.

Die beiden Monosaccharide sollten mit der Fehling-Reaktion, mit der die Aldehyd-Gruppe nachgewiesen wird,  unterscheidbar sein. Fructose enthält zwar keine Aldehyd-Gruppe, zeigt aber trotzdem eine positive Fehling-Reaktion, weil sie in alkalischem Milieu in Glucose umgewandelt werden kann.

Die Raman-Spektroskopie ermöglicht die Unterscheidung der beiden Monosaccharide.

*Auch der Begriff Isomerie stammt von unserem Namensgeber Jöns Jakob Berzelius. Auf die Idee der Existenz der Isomerie kam der deutsche Forschungsreisende Alexander von Humboldt (1769–1859). 1824 zeigten dann die Chemiker Wöhler und Liebig, beides Freunde von Berzelius, dass Knallsäure und Cyansäure die gleiche Zusammensetzung haben. Berzelius bewies 1829/30, dass Wein- und Traubensäure die gleiche Summenformal haben, worauf er 1830 den Begriff der Isomerie einführte.

Die Raman-Bande der C-C-Streckschwingung von Ethanol CH₃-CH₂-OH erscheint bei einer Wellenzahl von 885 cm ̄ ¹. 
Sie eignet sich sehr gut für quantitative (mengenmässige) Analysen, da in der Raman-Spektroskopie ein linearer Zusammenhang zwischen der Intensität der Raman-Banden und der Konzentration des für die Bande verantwortlichen Stoffes besteht. Dies gilt nur unter gleichen Messbedingungen, also bei gleicher Integrationszeit des Raman-Signals und gleicher Intensität des Laserlichts. Anhand einer Kalibriergeraden kann der Alkoholgehalt von Spirituosen ermittelt werden.

Die eingezeichneten Messpunkte zeigen die Intensität der Raman-Bande bei 885 cm ̄ ¹ als Funktion der Verdünnung von alkoholischen Lösungen. Zwischen der Ethanolkonzentration in Volumenprozent und der Intensität der Raman-Bande besteht ein linearer Zusammenhang. Dieser lässt sich durch die allgemeine Geradengleichung y = mx + b beschreiben (m ist die Steigung der Gerade, b der Achsenabschnitt). Der Determinationskoeffizient R² ist ein Mass, wie «eng» gestreut die Datenpunkte um die Gerade liegen. Der Wert vom 0.9935 liegt sehr nahe beim Wert einer perfekten Geraden
mit R² =1.

Die Raman-Spektroskopie ermöglicht so z. B. bei der Destillation von Wein die Bestimmung des Alkoholgehaltes der einzelnen Fraktionen. Die Intensität des Raman-Signals ist unter gleichen Messbedingungen ein Mass für die Alkoholkonzentration. 

Hier die Definition aus Artikel 63 der Verordnung des Eidgenössischen Departements des Innern (EDI) über Getränke:

1. Bier ist ein alkoholisches, kohlensäurehaltiges Getränk aus Wasser, gemälztem oder nicht gemälztem Getreide, Hefe und Hopfen, das durch alkoholische Gärung gewonnen wird. Es können auch weitere Zutaten verwendet werden.
   
2. Der Begriff «Hopfen» umfasst auch die Hopfenextrakte.
   

Bier ist aber viel mehr …

Bier ist für viele Menschen der Inbegriff von Geselligkeit und Genuss. Dabei ist den wenigsten bewusst, dass sie mit einem Glas Bier auch ein Stück Kulturgeschichte in der Hand halten. Die Anfänge des Bieres reichen weit bis in die Zeit vor Christus zurück, oder wie wir heute neutraler sagen: vor der Zeitrechnung (v. d. Z.).

Wann genau das Bier «erfunden» wurde, lässt sich kaum bestimmen – denn Menschen aus verschiedensten Kulturen brauten über Jahrtausende hinweg fermentierte Getreidegetränke. Die Sumerer in Mesopotamien gelten als frühe Brauer: Bereits um 3000 v. d. Z. stellten sie bierähnliche Getränke her. Auch im alten Ägypten spielte Bier eine bedeutende Rolle: Der Gott Osiris galt als Erfinder des Gerstenbieres und wurde als solcher verehrt.

Im Laufe der Geschichte trugen zahlreiche Kulturen – darunter Griechen, Römer und Germanen – zur Weiterentwicklung des Brauprozesses und zur Verbreitung des Bieres bei.

„Wir wollen auch sonderlichen, das füran allenthalben in unnsern Steten, Märckten und auf dem Lannde, zu kainem Pier merer Stückh, dann allain Gersten, Hopffen unnd Wasser, genommen und gepraucht sollen werden.“

Die Urfassung legte fest, dass Bier nur aus Wasser, Malz und Hopfen gebraut werden darf. Weil die genaue Wirkungsweise der Hefe im Brauprozess damals noch nicht bekannt war, wurde sie anfangs nicht als Zutat angesehen, später aber ausdrücklich hinzugefügt. Das Reinheitsgebot, das am 23. April 1516 durch den bayerischen Herzog Wilhelm IV. und seinen Bruder Herzog Ludwig X. erlassen wurde, verfolgte ursprünglich drei Ziele:

1. Die Menschen sollten vor überzogenen Bierpreisen geschützt werden.
   
2. Weizen sollte ausschliesslich für die Produktion von Brot und nicht von Bier verwendet werden. 
   
3. Die Zugabe von Zutaten, die dem Bier zwar eine gewisse Würze, Vollmundigkeit oder berauschende Wirkung verliehen, jedoch im Vergleich zu Hopfen und Malz minderwertig und oft sogar giftig waren, sollte verboten werden. Bierpanscher setzten ihrem Gebräu seinerzeit auch giftige Zutaten wie Stechapfel, Ruß oder Tollkirschen zu. 
   

Quelle: Entstehung - Deutscher Brauer-Bund

Bei der Methode der Standardaddition handelt es sich um eine sogenannte Aufstockkalibrierung. Dabei ist in jedem Messwert nicht nur die zugegebene, sondern auch die ursprüngliche unbekannte Konzentration das Analyten (hier: Ethanol im Bier) enthalten. Das bedeutet, dass die Kalibierfunktion deshalb gegenüber einer klassischen Kalibrierung um diesen unbekannten Wert entlang der x-Achse verschoben ist.  

Im vorliegenden Beispiel ergibt sich ein linearer Zusammenhang zwischen der zugegebenen Ethanolkonzentration (x) und der gemessenen Intensität des Raman-Signals (y) für die C-C-Streckschwingung. Die Regressionsgerade lässt sich durch folgende Gleichung beschreiben: 

y = 295.29 x + 451.6

Dabei beträgt die Steigung 295.29, der y-Achsen-abschnitt 451.6.
Der Determinationskoeffizient R² = 0.9881 zeigt, dass die Datenpunkte «eng» gestreut um die Gerade liegen – ein Indiz für eine hohe Präzision der Messung. 

Ohne zugeführten Ethanol beträgt der Wert von y = 0. Zur Bestimmung der ursprünglichen Ethanolkonzentration in der Probe ermitteln wir den Schnittpunkt der Regressionsgerade mit der x-Achse (also y = 0 gesetzt). Das ergibt:

0 = 295.29 x + 451.6 => x = -451.6/295.29 = -1.5 %
Da wir das Bier beim Aufstocken um den Faktor 2 verdünnt haben, müssen wir den Wert mit dem Faktor 2 multiplizieren, also 3 %. 

Dieser Wert von 3 % liegt deutlich unter dem auf der Flasche deklarierten Alkoholgehalt von 4.8 %. Die Abweichung lässt sich durch Matrixeffekte erklären: Die Biermatrix enthält zahlreiche stark fluoreszierende Substanzen wie Riboflavin, Polyphenole oder Aromastoffe. Diese können das Raman-Signal erheblich überlagern.

Hinweis:  Fluoreszenz ist ein optisches Phänomen, bei dem bestimmte Moleküle (Fluorophore) nach Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (Anregung) selbst Licht mit einer längeren Wellenlänge (Emission) abgeben. Diese überlagert häufig schwache Raman-Signale – ein typisches Problem bei biologischen oder komplexen Proben wie Bier. Mehr dazu gibt es hier.


 

Beim blauen Spektrum handelt es sich um eine 40 %ige Lösung von Methanol in Wasser ohne Ethanol. Bei diesem Spektrum fehlt logischerweise die Bande der C-C-Streckschwingung bei einer Wellenzahl von 885 cm ̄ ¹. In Anwesenheit von Ethanol erscheint diese Bande (siehe rote Kurve, wässrige Lösung von 26 % Ethanol und 14 % Methanol). Die Bande um 1022 cm ̄ ¹ ist typisch für Methanol. Sie ist mit einem Pfeil markiert. Diese Bande ermöglicht die Bestimmung von Methanol in alkoholischen Getränken.